U. maydis ist der Verursacher des Maisbeulenbrands. Voraussetzung für eine Infektion ist eine morphologische Veränderung von hefeartigem zu hyphalem Wachstum. Dabei findet das Wachstum an der Hyphenspitze statt während am basalen Ende Septen eingezogen und somit zytoplasmafreie Kompartimente gebildet werden. Bei diesem Prozess spielen RNA-bindende Proteine (RBPs) eine zentrale Rolle

Unser Fokus liegt auf den folgenden Forschungsaspekten:

• Vernetzung zwischen endosomalem mRNA Transport und dem mitochondriellen Energiemetabolismus während des polaren Wachstums
• Erforschung des Bindungsverhaltens des multi-RRM-Proteins Rrm4 während des endosomalen mRNA Transports
• Analyse der Bindung von Rrm4 an Endosomen mittels flexibler MademoiseLLE (MLLE) Domänen
• Einfluss des RNA-bindenden Proteins Khd4 auf die Morphologie und Pathogenität
• Untersuchung extrazelluläre Vesikel und ihrer mRNA Fracht

Rrm4 enthält drei N-terminale RRMs (RNA Erkennungsmotive) und drei C-terminale MademoiseLLE (MLLE) Domänen. Das Protein bewegt sich bidirektional entlang von Mikrotubuli in sogenannten mRNPs (messenger ribonucleic particles) und verteilt sowohl die gebundenen mRNAs als auch die assoziierten Proteine in der Hyphe. Die mRNPs werden auf Rab5a-positiven Endosomen co-transportiert. Am Transport beteiligten Motorproteine sind Kinesin-3 (Kin3) und das geteilte Dynein (Dyn1/2). Verlust von Rrm4 führt zu vermehrt bipolar auswachsenden Hyphen und verminderter Septen Bildung (C).

Transportiert werden zum Bespiel die Septin mRNAs und ihre kodierten Proteine sowie mRNAs die für die mitochondrielle Proteinuntereinheiten der F_OF₁ ATP Synthase kodieren.

Mitochondrien spielen eine zentrale Rolle für den Energiemetabolismus der Zelle. Unsere Forschung deutet darauf hin, dass mRNAs die für die mitochondriellen Proteine kodieren auf der endosomalen Oberfläche Rrm4-abhängig zu den Mitochondrien transportiert werden. Transkriptomweite in vivo Bindestudien haben gezeigt, dass Rrm4 die meisten kernkodierten mRNAs die für die Untereinheiten der F_OF₁ ATP Synthase kodieren, in der Nähe des Stopp-Kodons bindet. Dies weist auf eine enge Verbindung zwischen mRNAs Transport und Translation hin. Unserer Hypothese nach ist der Rrm4-abhängige Langstreckentransport, von mRNAs die für die mitochondriellen Proteine kodieren, essentielle für die Versorgung der Mitochondrien mit neu synthetisierten Proteinen. Um diese Hypothese zu beweisen, bedienen wir uns optogenetischer Methoden in Verbindung mit hochauflösender Mikroskopie und Mikrofluidik.

Transkriptomweite in vivo Analysen haben gezeigt, dass Rrm4 bevorzugt die 3´UTR (3´ untranslatierten Regionen), aber auch am Start und Stopp Kodon seine Ziel-mRNAs bindet. Darüber hinaus wird das Bindemotiv UAUG, welches überwiegend im offenen Leserahmen (OSF) und am Start Kodon vorzufinden ist, spezifische von der dritten RRM Domäne von Rrm4 gebunden. Die phänotypische Analyse hat jedoch ergeben, dass nur Mutationen in den beiden RRM Domänen (RRM1 und RRM2) zu einem Funktionsverlust führen. Dies deutet auf ein selektives Bindeverhalten der einzelnen RRMs hin. Um das Bindeverhalten der verschiedenen RRM Domänen von Rrm4 zu verstehen, wenden wir die individual-nucleotide resolution UV CrossLinking and ImmunoPrecipitation 2 (iCLIP2) Technik an. Dabei untersuchen wir Rrm4 Varianten mit Mutationen in den Domänen RRM1 (Rrm4^mR1), RRM2 (Rrm4^mR2) und RRM3 (Rrm4^mR3).

Rrm4 verfügt, anders als bisher bekannte Proteine, über drei C-terminale MLLE Domänen und bildet somit eine neuartige Protein-Protein-Interaktionsplattform. Upa1 fungiert dabei als Bindeglied zwischen den Endosomen und dem Rrm4-abhängigen mRNP, indem es über die FIVE Domäne an die Endosomen bindet, über das klassisches PAM2 mit Pab1 und über die zwei PAM2L Motive mit Rrm4 interagiert. Interessanterweise ist nur eine MLLE Domäne essentielle für die Anlagerung an die Endosomen, während die anderen beiden eine akzessorische Rolle spielen. Um die strukturelle Basis der MLLE Domäneninteraktionen während des endosomalen mRNA Transports besser zu verstehen, untersuchen wir derzeit die drei-dimensionale Struktur des Proteinkomplexes mittels Röntgenkristallographie und biochemischen in vitro Untersuchungen in Kombination mit funktionellen in vivo Analysen.

_{PAM2 (poly(A)-binding protein associated motif) / PAM2L (PAM2-like motif)}

Khd4 ist ein multi-KH RNA-bindendes Protein und ist sowohl für die Pilzmorphologie als auch Pathogenität essentiell. Khd4 enthält fünf KH-Domänen, wobei KH3 und 4 das mRNA Motiv AUACCC erkennen. Mutationen in diesen beiden Domänen führen zum Funktionsverlust. Genexpressionsanalysen haben gezeigt, dass der Verlust von Khd4 in Sporidien zu einem Anstieg an mRNAs führt, die in ihrer 3´UTR das AUACCC Bindemotive aufweisen. Dies legt nahe, dass Khd4 eine Rolle bei der Regulation der Ziel-mRNA Mengen spielt. Der Zusammenhang zur Zellmorphologie und Pathogenität ist jedoch noch unklar. Deshalb versuchen wir zu verstehen, welche Rolle Khd4 bei der post-transkriptionelle Regulation während der einzelnen Phasen des Lebenszyklus in U. maydis spielt. Die RNA Editierungstechnik hyperTRIBE ist dabei ein wichtiges Tool, um die Khd4 Ziel-mRNAs in vivo zu identifizieren.

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind wichtige Vermittler von Pflanze-Pathogen Interaktionen. EVs können unteranderem mRNAs enthalten und sind somit für die Erforschung neuartiger pathogener Effektoren von großer Bedeutung. Der zentrale Forschungsaspekt ist daher die Charakterisierung von Effektor Kandidaten, die in EVs enthalten sind. Darüber hinaus erforschen wir, wie die Biogenese und Frachtauswahl der EVs funktionieren. Wir verwenden Hochdurchsatzsequenzierung (NGS) und Proteomics sowie konfokale und Elektronenmikroskopie, um die EV-vermittelten Interaktionen im Detail zu untersuchen. Aus dem Repertoire der mit EVs assoziierten mRNAs wurde ein Set von mRNA Effektorkandidaten für die weitere Analyse ausgewählt. Wir nehmen an, dass U. maydis während der Infektion mRNA in EVs sekretiert, die Effektoren kodieren. Diese werden möglicherweise in der Maiszelle entladen und translatiert, was eine sehr effektive Infektionsstrategie darstellen würde.

S. K. Devan^$, S. Schott-Verdugo^$, K. Müntjes, L. Bismar, J. Reiners, E. Hachani, L. Schmitt, A. Höppner, S. H. J. Smits*, H. Gohlke*, M. Feldbrügge * (2022) A MademoiseLLE domain binding platform links the key RNA transporter to endosomes. PLoS Genet., 18(6): e1010269.
$ shared first authorship, * shared corresponding authorship

doi Pubmed

K. Müntjes, S. K. Devan, A. Reichert and M. Feldbrügge (2021) Linking transport and translation of mRNAs with endosomes and mitochondria. EMBO Rep. e52445 online ahead print
doi      PubMed

S. Kwon, O. Rupp, A. Brachmann, C. F. Blum, A. Kraege, A. Goesmann and M. Feldbrügge (2021) mRNA inventory of extracellular vesicles from Ustilago maydis. J. Fungi 7: 562
doi      PubMed      Editor's Choice

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